Patent translation

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(57)【要約】
【課題】ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞に対して、簡便、安全且つ効率良く、ペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子を導入すること。
【解決手段】ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞に、トランスフェクション試薬の共存下に、ペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子の導入を行うことを特徴とする方法。
【選択図】　なし


【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞にペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体を導入する方法であって、該方法をトランスフェクション試薬の共存下に行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞に金属微粒子を導入する方法であって、該方法をトランスフェクション試薬の共存下に行うことを特徴とする方法。
【請求項３】
トランスフェクション試薬が脂質を主成分とする試薬である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
トランスフェクション試薬がカチオンリポソームである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
原核細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
金属微粒子が、鉄、酸化チタン、白金及び金からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子とトランスフェクション試薬とを含むトランスフェクションキット。


【実施例】


以下に、実施例を示し、本発明の特徴とするところをより一層明瞭にする。


【００４９】


実施例１

　＜β－ガラクトシダーゼの導入＞


０．２５μｇ／μｌ のβ－ガラクトシダーゼ溶液を４μｌずつ３本のマイクロチューブに分注し、１本目はそのまま、２本目はカチオンリポソーム　ＤＯＴＡＰ　 Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）４μｌを、３本目にはＣｈａｒｉｏｔ　ＫｉｔのＣｈａｒｉｏｔ　 Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｃｔｉｖｅ　Ｍｏｔｉｅｆ社　２ｍｇ／ｍｌ）８μｌを室温にて混合し、１５分放置した。


【００５０】


大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ）を、前記の３本のマイクロチューブそれぞれに加え、氷上にて５分おいた後、３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養した。


【００５１】


この細胞液をそれぞれマイクロチューブに移し、５０００ｒｐｍにて１分遠心し上清をのぞき、ＰＢＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（１．５ｍＭ　ＫＨ

２

ＰＯ

４

，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　５ｍＭ　Ｎａ

２

ＨＰＯ

４

）にて、２回遠心、洗浄した。


【００５２】


この菌体を、ＬＢ培地にて懸濁し、１時間３７℃にてインキュベートしたのち、再度遠心し上清をのぞき、０．０５％のＸｇａｌを含むＬＢ培地に懸濁してさらに１時間インキュベートした。


【００５３】


菌 体懸濁液を顕微鏡下で観察したところ、トランスフェクション試薬であるＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔでは ３０％程度、Ｃｈａｒｉｏｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔでは２０％程度、β－ガラクトシダーゼ活性を示す青色に染まった菌体が観察され た。しかし、トランスフェクション試薬を含まなかったものには、青色に染まった菌体が観察されなかった。


【００５４】


実施例２

　＜　ＤＮＡタンパク質複合体の導入　＞


（１）Ｔｎ５トランスポゼースをＣＲＵＺらの手法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１７５、　Ｎｏ．２１、　ｐ．６９３２－６９３８、１９９３）により精製した。


【００５５】


（２）

カナマイシン

耐性のＴｎ５トランスポゾンＥＺ：：ＴＮ

ＴＭ

＜ＫＡＮ２＞Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ 　（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）１５μｇ／ｍｌ溶液　０．４μｌ（０．００７５ｐｍｏｌ）とＴｎ５トランスポゼース ０．４μｌ（０．１ｐｍｏｌ相当）を静かにタッピングにて混合し、３７℃にて１０分間インキュベートした。


【００５６】


（３）インキュ ベートした混合物を０．４μｌずつ３本のマイクロチューブに分注し、１本目はそのまま、２本目はカチオンリポソーム　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　 Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）０．４μｌを、３本目にはＣｈａｒｉｏｔ　ＫｉｔのＣｈａｒｉｏｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ 　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｃｔｉｖｅ　Ｍｏｔｉｅｆ社　２ｍｇ／ｍｌ）２．０ｍｌを室温にて混合し、１５分放置した。


【００５７】


（４）大腸 菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ）を、前記の３本のマイクロチューブそれぞれに加え、氷上にて５分おいた後、３７℃に温めておいた ＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、カナマイシンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。


【００５８】


トランスポゾン１μｇあたり、ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔを混ぜた方では４．０×１０

３

株、Ｃｈａｒｉｏｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔを混ぜた方では２．０×１０

３

株の

カナマイシン

耐性の形質転換株が得ら、それぞれのトランスフェクション試薬を混ぜなかったものでは形質転換体が得られなかった。


【００５９】


（５）この際に得られた形質転換株にはプラスミドは存在せず、これらの形質転換体がトランスポゼースによってゲノムに遺伝子が導入されたものであることがわかった。


【００６０】


実施例３

　＜金属微粒子の導入＞


磁 性粒体：Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ　Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を遠心回収し、 ０．６ｍｇを１０μｇ／μｌにＭｉｌｉ－Ｑ水に懸濁した。アンピシリン耐性を示すｐＵＣ１９　ｐｌａｓｍｉｄを含む大腸菌ＤＨ５αセルをＬＢ培地にて培養 し、ＯＤ６００＝０．６で遠心回収し、Ｍｉｌｉ－Ｑ水にて３回洗浄した後、ＯＤ６００＝１０．０程度となるようにＭｉｌｉ－Ｑ水にて懸濁した。


【００６１】


５本のマイクロチューブに上記の大腸菌を５０μｌずつ分注し氷の上に置いた。その５本のマイクロチューブをａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅと名付け、それぞれのマイクロチューブに以下の組成のものを添加した。


ａ：大腸菌のみ


ｂ：大腸菌＋磁性粒体５μｌ


ｃ：大腸菌＋ＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ社１μｇ／１μｌ）５μｌ


ｄ：大腸菌＋磁性粒体５μｌ＋　ＤＯＴＡＰ　５μｌ（別々に加える）


ｅ：大腸菌＋（磁性粒体５μｌ＋ＤＯＴＡＰ　５μｌを３７℃で５分インキュベートしたもの）。


【００６２】


そ れぞれ、氷上にて５分間静置した後、４２℃で９０秒間ヒートショックを行い、３７℃のＳＯＣ培養液１ｍｌにて懸濁した。ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ　 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｓｔａｎｄｓを用いて１分放置することで、磁性粒体を含む画分を回収し、上清を取り除い た。


【００６３】


同様の操作を３回繰り返し、磁性粒体を含む画分を回収した。回収した菌体をＳＯＣ培養液０．１ｍｌにて懸濁し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含むＬＢプレートに植菌し、３７℃一晩培養した後、生じたコロニーの数を計測した。


【００６４】


コロニーを生じたのは、ｂが１株、ｅが８７株であり、磁性粒体により菌体が回収されたことが示された。ｅの菌体を拡大して観察したところ、磁性粒体と思われる黒い粒が菌体内に見られたが、他の条件の菌体には細胞内には黒い粒は観察されなかった。